I ricercatori di terapia genica della UMass Chan Medical School hanno mostrato la prima prova che una terapia con soppressore di trasferimento dell’RNA (tRNA) può ripristinare la produzione di proteine fino a sei mesi dopo il trattamento in un modello murino della rara malattia genetica mucopolisaccaridosi di tipo I, secondo un nuovo documento pubblicato in Natura.
Guangping Gao, Ph.D., Dan Wang, Ph.D. e colleghi riferiscono di “tRNA soppressori di sciocchezze che operano su codoni di terminazione prematura” forniti da AAV o AAV-NoSTOP in breve. La ricerca supporta lo sviluppo di una nuova cassetta degli attrezzi di terapie con tRNA soppressori che possono potenzialmente ripristinare la funzione del gene nativo in una serie di tessuti, inclusi cuore, muscoli, cervello e fegato, alleviando così le malattie genetiche causate da mutazioni premature del codone di stop.
La sostituzione genica e le terapie transgene si concentrano sulla riparazione o sulla ricostruzione del materiale genetico difettoso per produrre un effetto terapeutico. Gli attuali approcci alla terapia genica devono affrontare sfide quali tossicità, effetti fuori bersaglio indesiderati e reazioni immunitarie dannose. Nel frattempo, i macchinari per l’editing genetico come i sistemi basati su CRISPR possono essere difficili da fornire, a causa delle loro dimensioni e dello spazio di carico limitato della maggior parte dei meccanismi di consegna. Poiché le terapie con tRNA utilizzano il macchinario per la produzione di proteine cellulari native della cellula e sono relativamente piccole, hanno il potenziale vantaggio di ripristinare la regolazione genica endogena con un minor numero di queste sfide. I limiti tecnologici, tuttavia, hanno impedito agli scienziati di condurre studi formali sulla sicurezza, l’efficienza e l’efficacia di una terapia genica con tRNA in un modello animale di malattia.
“Il nostro è il primo studio formale a fornire prove in un modello animale di una malattia umana che le terapie basate sul tRNA possono ripristinare in sicurezza l’espressione genica”, ha affermato il dottor Wang, assistente professore di terapia dell’RNA. “Mostriamo che è possibile fornire una piattaforma di tRNA in vivo con sicurezza ed efficacia a lungo termine in un animale malato. Raggiungendo l’espressione genica a lungo termine in un animale, il tRNA soppressore apre una nuova opportunità per costruire terapie geniche per un un’ampia gamma di malattie genetiche”.
Gli RNA di trasferimento svolgono un ruolo fondamentale nel modo in cui le proteine vengono prodotte all’interno di una cellula. Sono responsabili dell’unione fisica dei vari amminoacidi che, una volta combinati, formano proteine funzionali. Simile all’RNA messaggero (mRNA), che contiene le istruzioni per assemblare gli amminoacidi nel giusto ordine per formare le proteine, ogni molecola di tRNA collega fisicamente gli amminoacidi alla sequenza di mRNA corretta. Questi tRNA si legano agli amminoacidi e li trasportano al macchinario per la produzione di proteine nella cellula chiamato ribosoma. Sulla punta di ciascun tRNA c’è un anticodone, una sequenza di tre nucleotidi. Questo anticodone corrisponde a una sequenza complementare lungo il filamento di mRNA. Quando il ribosoma “legge” l’mRNA, il tRNA è responsabile dello spostamento e quindi del trasferimento del suo amminoacido nella posizione corretta lungo la sequenza dell’mRNA.
All’interno di ogni libretto di istruzioni dell’mRNA ci sono indicazioni aggiuntive, chiamate codoni di arresto, che indicano al macchinario del ribosoma quando una proteina è completa e quando interrompere l’aggiunta di aminoacidi. In alcuni casi, tuttavia, una singola mutazione nucleotidica all’interno di un gene può far sì che il ribosoma smetta prematuramente di costruire proteine. Questi codoni di arresto prematuro producono proteine incomplete che possono diventare tossiche per la cellula o risultare in proteine che non sono più in grado di svolgere la loro funzione richiesta, in alcuni casi ne derivano sia tossicità che perdita di funzione.
“Circa l’11% di tutte le malattie genetiche è causato da una singola mutazione nucleotidica che si traduce in un codone di arresto prematuro”, ha spiegato il coautore Dr. Gao, il professore di ricerca biomedica Penelope Booth Rockwell, professore di microbiologia e sistemi fisiologici, direttore di il Centro di terapia genica Horae e condirettore del Li Weibo Institute for Rare Diseases Research. “Potrebbe essere possibile progettare una piattaforma terapeutica che utilizzi la terapia con tRNA soppressore per trattare altre malattie che si formano a causa di codoni di arresto prematuro. Ciò includerebbe alcuni tipi di fibrosi cistica e distrofia muscolare”.
Wang e Gao hanno sviluppato un tRNA soppressore che consente al macchinario del ribosoma di saltare questi codoni di arresto prematuro, facendo sì che l’apparato di produzione delle proteine continua a costruire una proteina completa e funzionale. Distribuendo la loro terapia con tRNA, somministrata da un virus adeno-associato ricombinante (rAAV) a topi con una mutazione nel gene chiamato IDUA, i ricercatori hanno dimostrato che è possibile ripristinare i livelli proteici funzionali e non hanno osservato alcun effetto collaterale.
Le mutazioni del gene IDUA causano il disturbo da accumulo di lisosomi mucopolisaccaridosi di tipo I. Il gene IDUA fornisce istruzioni per produrre un enzima chiamato alfa-L-iduronidasi, che è essenziale per abbattere grandi molecole di zucchero chiamate glicosaminoglicani (GAG). La mancanza di attività dell’enzima alfa-L-iduronidasi porta all’accumulo di eparan solfato e dermatan solfato all’interno dei lisosomi. I ricercatori ritengono che i GAG accumulati possano anche interferire con le funzioni di altre proteine all’interno dei lisosomi e interrompere il movimento delle molecole all’interno della cellula.
Gao e Wang hanno scelto di testare il loro AAV-NoSTOP sulla mucopolisaccaridosi di tipo I perché gli effetti biochimici della malattia sono presenti in tutto il corpo, consentendo lo studio di più tipi di tessuto.
Sebbene le tecnologie tRNA siano in circolazione da più di 40 anni, la traduzione della tecnologia in terapie è stata rallentata dall’incapacità di valutare gli impatti biochimici della modifica delle sequenze di tRNA. Wang e Gao sono stati in grado di utilizzare tecnologie di nuova concezione nella profilazione del ribosoma e nel sequenziamento del tRNA per interrogare biochimicamente i loro risultati e valutare i potenziali effetti fuori bersaglio.
I risultati della ricerca supportano l’idea che un tRNA soppressore possa ripristinare la normale produzione di proteine, ha affermato Wang. Tale piattaforma eliminerebbe la necessità di fornire un gene a lunghezza intera che potrebbe superare il limite di confezionamento dei vettori AAV ed evitare risposte immunitarie dannose causate da tecnologie di editing genetico come le proteine associate a CRISPR.
“Se combinata con la tecnologia di consegna del gene basata su AAV in fase di sviluppo per diversi tessuti, una piattaforma AAV-NoSTOP sarebbe un’aggiunta clinica potenzialmente preziosa allo sviluppo di terapie basate sui geni”, ha affermato Gao.